作者：辽宁医学院畜牧兽医学院 王东梅王维新
摘要为探讨复方中草药对刺参免疫的影响，将由9味中草药配伍的复方中草药粉碎制剂，以质量分数分别为1%、2%、3%和4%的剂量添加于基础饲料中，连续投喂刺参24d，以基础饲料饲喂组为对照。
于投喂后第7天、第10天、第14天、第18天和第24天测定酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)与超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果显示，投喂后24d内，各试验组ACP、AKP、NOS与SOD活性均随时间延长先升高后降低。2%复方中草药试验组的ACP活性在投喂后第14天活性最高，值为6.93U/100mL，与对照组具有显著性差异，投喂后第10天时AKP活性最高，2%复方中草药试验组为3.25金氏单位/100mL，3%和4%复方中草药试验组与对照组具有显著性差异，1%和2%复方中草药试验组与对照组差异极显著；NOS和SOD活性在投喂后第18天达到最高，分别为10.78和138.05U/mL，
3%复方中草药组的NOS活性与对照组具有显著性差异，1%和2%复方中草药试验组的SOD活性与对照组间差异显著，3%复方中草药试验组与对照组间差异极显著。研究结果表明:复方中草药能提高刺参的免疫功能。
关键词刺参复方中草药酸性磷酸酶碱性磷酸酶一氧化氮合酶超氧化物歧化酶
刺参作为重要的食物和药物资源，很早就被人类利用到养生、保健和治疗上。在我国，目前刺参的人工养殖已成为一项新兴的且前景广阔的养殖产业。然而，近几年刺参细菌性与病毒性疾病大面积发生，造成刺参养殖产业损失惨重。刺参疾病防御已成为当务之急。目前，抗生素及化学药品治疗给动物自身、动物产品及环境带来一系列的问题。如:动物病原菌产生抗药性，引起内源性感染和二重感染，特别是长期使用会造成消化道内微生态失调和环境污染，同时药品在生物中的残留还直接影响人类健康。因此，国家对这类药物的使用已作了严格的限制。
现已证明有200余种中草药含有多种免疫活性物质，这些免疫活性物质能调节动物机体的免疫功能，中草药已被广泛地应用于水产养殖中。张明、郑天伦和毛芝娟等报道，中草药对鳗、大黄鱼及锯缘青蟹的疾病有显著的预防效果；穿心莲、大青叶和金银花等复方中草药可以有效抑制或杀灭刺参病原菌，增强刺参非特异性免疫功能；吴亚楠等以黄芪和党参为主药制成的复方中草药可以显著提高刺参的免疫力和抗病力。试验以9味中草药制成复方中草药制剂，研究口服不同剂量对刺参体腔液酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，以期探讨复方中草药与刺参非特异性免疫间的关系，旨在为疾病防治寻找契机，同时也为棘皮动物非特异性免疫研究积累基础资料。
1材料与方法
1.1材料
健康刺参购自辽宁锦州金域刺参良种场，体长(4.0±0.35)cm，体质量(3.0±0.45)g。将刺参饲养于12L塑料水槽中，水温(17±1)℃，pH(8.1±0.2)，海水盐度为(29±2)‰，每箱饲养20头刺参，日投喂1次(下午16∶00)稚参饲料并换水30%。驯养1周后用于试验。
复方中草药配方为黄芪、党参、白术、茯苓(去皮)、炙甘草、山楂、元参、板蓝根和穿心莲。
所用中草药购自锦州健康源大药房，粉碎后过100目筛。将粉碎后的中草药分别以质量分数为1%、2%、3%和4%的比例添加到基础饲料中。
1.2试验设计
试验分5个处理组，分别为对照组(A组)，投喂基础饲料；1%(质量百分比)复方中草药组(B组)、2%复方中草药组(C组)、3%复方中草药组(D组)和4%复方中草药组(E组)，每组设3个平行，每平行饲养20头刺参。采用口服法对其投喂24d。投喂期间仍每天按时换水并测量温度、盐度和pH等各项水质指标，定时观察刺参生长及健康状况。分别于投喂后第7天、第10天、第14天、第18天和第24天测定刺参各种免疫指标。
1.3样品制备
每次从各组中取出2头刺参，分别从刺参腹部靠近肛门约1cm处抽取体腔液，匀浆器研磨后离心(4000r/min，4℃，10min)，取上清液，4℃保存。
1.4酶活性的测定
ACP、AKP、NOS和SOD活性使用试剂盒测定。ACP、AKP和NOS活性按照血清中此酶检测方法测定；SOD活性按照血清中总超氧化物歧化酶活力法测定。NOS和SOD测定时取样量为20μL。
1.5数据处理
数据用SPSS13.0软件进行单素方差分析(One－wayAN0VA)，结果以平均值±标准差表示，当P＜0.05时认为差异显著。
2结果与分析
2.1复方中草药对刺参ACP活性的影响
从图1可见:复方中草药各试验组在投喂后24d内ACP活性先升高后降低。其中第14天，C组ACP活性达到最高值为6.93U/100mL是对照组的6.1倍。表明2%复方中草药试验组效果最佳。经统计分析，C组与A组间差异显著，其他组间差异不显著。
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2.2复方中草药对刺参AKP活性的影响
从图2可见:复方中草药同样能提高刺参体腔液中AKP活性。在口服后24d内AKP活性随时间延长先上升后降低，在第10天时明显增强，C组AKP活性最高，为3.25金氏单位/100mL，是对照组的3.1倍；经统计分析，D和E组均与A组差异显著；B和C组与A组间差异极显著，试验组间差异不显著。
2.3复方中草药对刺参NOS活性的影响
从图3可见:饲料中添加复方中草药不同程度地提高了刺参体腔液NOS活性。各试验组在投喂后24d内NOS活性先升高后降低。口服后第18天，D组NOS活性为10.78U/mL，是对照组的8.6倍。经统计分析D组与A组间差异显著，其他组间差异不显著。
2.4复方中草药对刺参SOD活性的影响
从图4可见:复方中草药各试验组在投喂后24d内刺参体腔液中SOD活性均升高，活性随时间延长而先升高后降低。在口服第18天，以D组SOD活性最高，值为138.05U/mL，是A组的2.5倍；B和C组与A组间差异显著，D组与A组间差异极显著，而其他组间差异不显著。
3讨论
ACP、AKP、NOS及SOD是生物体内重要的非特异性免疫因子。在解毒、增强营养物质消化吸收、抵抗外来病源入侵和增强机体抗氧化能力等方面起重要作用。
ACP是溶酶体的重要组成部分，是巨噬细胞溶酶体的标志酶。研究用ACP的活性表示吞噬细胞清除异物的能力。结果表明:口服不同剂量复方中草药后24d内刺参体腔液ACP活性均比对照组高，2%复方中草药试验组效果最佳；口服后第14天酶活性达到最大值，之后逐渐下降，这可能与免疫疲劳有一定关系，关于其内在机制还需要进一步的研究。
AKP生物学意义重大，不仅在细胞膜上较为活跃，在体能细胞代谢过程中也具有重要作用。AKP普遍存在于动植物体内，是一种对底物专一性要求较低的磷酸单脂水解酶，是重要的解毒系统，在碱性条件下，可使磷酸单脂水解生成乙醇和磷酸，并与一些营养物质的消化吸收有关系。研究结果表明:与对照组相比，口服不同剂量复方中草药后24d内，刺参体腔液AKP活性升高，所有试验组具有显著性差异，2%复方中草药试验组AKP活性最高是对照组的3.1倍，AKP活性先升高后降低。樊英在刺参AKP酶活性试验中也得到了同样的结果。
NOS催化L－精氨酸，在体内合成与多种免疫活性有关的内源性NO，从而改变机体的免疫能力，包括通过阻止DNA、蛋白和脂质合成而具有的抗菌和抗病毒活性。在试验中，口服不同剂量复方中草药后24d内，刺参体腔液NOS活性先升高后降低，3%复方中草药试验组NOS活性最高，值为10.78U/mL，是对照组的8.6倍，与对照组间差异显著。陈效儒在饲料中添加200mg/kg的甘草酸提高了刺参体腔细胞的NOS活性。
SOD是机体内抗氧化酶系的关键酶之一，能清除机体内的超氧自由基，它的主要功能是清除体内产生的超氧化阴离子自由基。机体内该酶的活性高低反映了抗氧化能力的大小。正常情况下，由于SOD等诱导酶的作用会及时清除自身过多的自由基。但在疾病或逆境条件下，生物体的抗氧化能力下降。所以，SOD也是衡量生物体健康状况的一个主要指标。有研究报道，SOD活性与生物的免疫水平密切相关，对于增强吞噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重要作用，试验中口服不同剂量复方中草药提高了刺参体腔液中SOD活性，增强抗氧化能力，这与黄芪成分中的黄酮和皂甙消除氧自由基的作用相关。在口服第18天，以3%复方中草药试验组SOD活性最高，值为138.05U/mL，与对照组间差异极显著。酶活性先升高后降低的趋势与樊英等对刺参注射黄芪多糖免疫的影响研究一致。
黄芪对史氏鲟的研究证明了它对机体的影响有益，SOD活性升高，脂质过氧化物的生成减少，不同剂量的黄芪使SOD活性升高的幅度。
4结论
研究表明:通过口服途径，复方中草药能不同程度地增强刺参体腔液中免疫因子ACP、AKP、NOS及SOD活性。因此，复方中草药能对刺参体内酶系统产生积极的调理作用，使其非特异性免疫得到改善和提高。这为刺参饲料的研发提供了重要依据。饲料的适口性及样品采集和处理过程可能破坏了部分体腔细胞，致使测定结果存在一定的差异。因此，复方中草药对刺参的免疫效果还需进一步深入研究。
