夏凌志1 张银萍2 王 丹2
（1.辽宁省鞍山市台安县兽药饲料监督检验所 114100，2.辽宁省鞍山市台安县动物疫病预防控制中心 114100）
1 病料的采集
先用消毒液将采集病料场所周围的环境用3%来苏儿进行消毒，按剖检术式将病畜剖检，在打开采集部位之前将酒精灯点燃作无菌防护，将病畜的肝脏用镊子夹起，用手术刀或手术剪将其采集放入无菌容器内保存或送检，将尸体按规定处理。
病料的采集和运输过程中要保持相对无菌状态。将要采集病料的尸体不能死亡时间过长，一般不超过12小时。如实验室较远需要运输，可加入保护剂如30%甘油生理盐水。要标明病料来源及采集时间、部位及临床症状和剖检变化。
2 病料的实验室处理
将金属器械用高压灭菌，其他塑料制品可用煮沸灭菌30分钟。无菌室灭菌后用天平称取3克的病料放在研钵内，加入5毫升的生理盐水进行稀释研成粥状，再用量筒定窬到15毫升具塞离心管内，进行3 000转15分钟，取上清液，再加入青链霉素混合液，放在4℃冰箱内感作4小时或过夜，作无菌检验，在放入冰箱内冷冻保存备用。此时做一次血液凝集实验，检测病毒效价，如毒效价高可直接作血凝抑制实验，反之做鸡胚接种进行增毒。
3 鸡胚接种
选健康无病的鸡群，以来航鸡蛋或其化白壳蛋为好，9~11日龄为好。温度一般为37.5℃，相对湿度以60%为好，运输要防震。金属器材用高压灭菌器消毒121.3℃ 20~30分钟，塑料制品煮费消毒30分钟，其他用紫外线照射15~30分钟。选择10日龄鸡胚，用照蛋器照视后选择血管明显，胎儿发育良好者，用记号笔划出气室、胚头。
接种，将待用消毒器材与鸡胚一同带入无菌室，在酒精灯10厘米范围内进行操作。将鸡胚置于蛋座上，消毒打孔器，用碘酊棉球在气室上方由内向外画同心圆，再用酒精棉球同样方法脱碘。用打孔器于消毒气室的中央打孔。用1毫升注射器吸取病毒提取液0.1毫升，于打孔处进针约1.5厘米缓慢将病毒提取液注入，迅速将注射器拔出。用溶化好的石蜡封住针孔，此后将鸡胚放入37℃的恒温箱中孵化。24小时后照蛋，24小时内死的弃去。在放入孵化器内孵化，每12小时照蛋1次。死亡蛋马上放入4℃冰箱内保存。如72小时后不死亡也放入到4℃冰箱内冻死。
4 鸡胚尿囊液的收集
金属器材用高压灭菌器消毒121.3℃ 20~30分钟，塑料制品煮沸消毒30分钟。将冰箱内的鸡胚取出，进入无菌室内，气室向上置于蛋痤上，在酒精灯10厘米范围内进行操作。将尿囊液放入青霉素小瓶内盖好瓶盖做好标记。
5 血液凝集实验
将横向第1~12孔分别标好序号1~12。（www.nczfj.com）先向第一孔致第12孔各加25微升生理盐水。再向第一孔内加25微升尿囊液。混均后吸出25微升加入第二孔，如此倍比稀释到第11孔，从第11孔吸出25微升弃去。在向第一致第12孔分别加入25微升1%鸡红细胞，观察结果。以100%凝集的病毒的最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者RBC沉于孔底呈现点状。此次实验结果，做4组平行实验结果完全凝集，即为一个血凝价。
6 血液凝集抑制实验
实验方法，横向标定“-”、新城疫“ND”、“ND/AI”、禽流感“AI”、“+”，共五孔。第一次加样，先将第一孔内加50微升生理盐水，第二孔内加25微升ND阳性血清，第三孔内加入25微升ND/AI 1∶1混和阳性血清，第四孔内加入25微升AI阳性血清，第五孔不加。第二次加样，第一孔不加，第2~4孔分别加入25微升代检尿囊液，第五孔加入50微升代检尿囊液。30分钟后第三次加样。第1~5孔每孔各加25微升1%鸡红细胞，30分钟观察结果。
可有五种情况出现：1、2、3孔出现抑制（阳性），其他都发生凝集，说明该尿囊液中含有ND病毒；1、3、4孔出现抑制，其他都发生凝集，说明该尿囊液中含有工AI病毒；1、3孔出现抑制（阳性），其他都发生凝集，说明该尿囊液中含有ND和AI病毒；1孔为阳性，其他各孔发生凝集则结果为该尿囊液中不含有ND或AI，可能含为其他具有凝集特性的病毒；5孔全发生抑制或凝集或1号为阳性5号为阴性则实验失败。在此次实验中，1、2、3孔被抑制，4、5孔五发生凝集，说明该尿囊液中含有ND病毒。
