对人工养殖黄颡鱼（PelteobagrusfulvidracoRichardson）能造成严重危害的致病菌种类较多，如柱状黄杆菌（Flavobacteriumcoloumnare）能引起细菌性溃疡病等。对于由致病细菌引起的疾病大多采用各种抗菌素类药物进行治疗。在同一个养殖水体中多次使用同种抗菌素会导致病原菌的耐药性增加，使药物治疗疾病的效果越来越差。此外，抗菌药物的大量使用还可能造成养殖鱼体内的药物残留超标，甚至引起公共卫生方面的问题。
由于各种致病菌对不同种类的抗菌素产生耐药性的机制不同，而且产生速度和消失速率也是有所不同的。因此，了解致病菌对抗菌素耐药性的产生和消失速率，是决定抗菌素药物的使用程序的基础。本研究在离体条件下，检测了从患病黄颡鱼上分离的F.coloumnare菌株对烟酸诺氟沙星的耐药性获得与消失速率，旨在为制定该抗菌素用于黄颡鱼细菌性疾病治疗的科学用药程序提供基础资料。
1材料与方法
1.1供试药物
将烟酸诺氟沙星（NicotinicacidNorfloxacin，Rochi，批号：130305，购自中国兽医药品监察所）作为本研究的供试药物。
1.2供试菌株
2012年5~6月和2013年3~5月，从江苏省射阳县黄沙港养殖区和浙江省菱湖地区的养殖场饲养的患病黄颡鱼体内，分离的F.coloumnareHS-120605、HS-120607、HS-130301和HS-130308等4个菌株用于本研究。菌株分离的时间、地点和病鱼器官等详细情况见表1。
表1供试菌株的来源
1.3供试菌株最小抑菌浓度的测定
按照日本化学疗法学会制定的标准法，首先将烟酸诺氟沙星用灭菌生理盐水分别稀释至1,000.0mg/L的浓度。然后在无菌条件下，用灭菌后的胰蛋白胨液体培养基将药物稀释10倍，从而使培养基中药物的浓度达到100.0mg/L的浓度。再用定量移液枪向每支盛有2.9mL胰蛋白胨液体培养基的试管中加入2.9mL含有药物的培养基，将试管在混悬器上混合均匀后，从中吸取2.9mL含有药物的胰蛋白胨液体培养基加到下一试管中，以此类推制作成药物浓度分别为100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀释药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL浓度约为1.2×106cfu/mL活菌液（比浊法测定）加入上述每支试管中，摇匀。置于25℃条件下培养72h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）。
1.4供试菌株耐药性获得速率的测定
在上述测定的烟酸诺氟沙星对F.coloumnare的药敏试管中，从肉眼观察有细菌生长的最低药物浓度的试管中吸取0.1mL培养基，将其接种在含有不同浓度烟酸诺氟沙星的胰蛋白胨液体培养基试管中，在25℃条件下培养72h后，从经肉眼观察证实有细菌生长的最低药物浓度的试管中，吸取0.1mL培养基分别按照1.3项的方法测定烟酸诺氟沙星对其中F.coloumnare的MIC。上述相同的操作连续进行9次，即使F.coloumnare在含有烟酸诺氟沙星的药物培养基中传代9次将最后测定的MIC与最初的MIC比较，评价F.coloumnare菌株对烟酸诺氟沙星耐药性获得速率。
1.5供试菌株耐药性消失速率的测定
将在药物培养基中经过连续传代9次证明其均已经获得较高耐药性的F.coloumnare4个菌株，以琼脂内穿刺法将其分别接种在盛有不含烟酸诺氟沙星的胰蛋白胨琼脂培养基的试管中，在4℃条件下保存，每间隔20d以同样的方法传代1次，连续传代5次。按照1.3项的方法测定烟酸诺氟沙星对每次传代后培养基中F.coloumnare的MIC。将对传代5次后测定的MIC与最初的MIC比较，评价F.coloumnare菌株对烟酸诺氟沙星耐药性消除速率。
2结果
2.1供试菌株对烟酸诺氟沙星的敏感性
烟酸诺氟沙星对F.coloumnare4个菌株MIC的测定结果如表2所示。由表2的结果可见烟酸诺氟沙星对HS-120605、HS-120607、HS-130301和HS-130308等4个菌株的MIC均不一样，HS-120605菌株的MIC为0.39mg/L、HS-120607菌株的MIC为0.20mg/L，而HS-130301和HS-130308等2个菌株的MIC均为0.78mg/L。
表2柱状黄杆菌对烟酸诺氟沙星的敏感性
2.2供试菌株对烟酸诺氟沙星耐药性产生速率
F.coloumnare的4个菌株经过连续9次在含有烟酸诺氟沙星的胰蛋白胨液体培养基中传代培养，菌株对烟酸诺氟沙星耐药性变化的状况如表3所示。由表3可以看出，4个菌株在含有烟酸诺氟沙星的培养基中传代9次后，均获得了比较强的耐药性，其中HS-120605菌株的MIC由0.39mg/L上升到了1.56mg/L、HS-120607菌株的MIC由0.20mg/L上升到了0.78mg/L，而HS-130301和HS-130308等MIC由0.78mg/L上升到了3.13mg/L。即经过在含有烟酸诺氟沙星的培养基中传代9次后，烟酸诺氟沙星对F.coloumnare4个菌株的MIC值均上升了4倍。
表3柱状黄杆菌对烟酸诺氟沙星耐药性产生速率
2.3供试菌株对烟酸诺氟沙星耐药性消除速率
将获得了较强耐药性F.coloumnare的4个菌株在不含烟酸诺氟沙星的胰蛋白胨液体培养基中连续5次传代培养后，其中HS-120605菌株的MIC由1.56mg/L下降到了0.78mg/L、HS-120607菌株的MIC由0.78mg/L下降到了0.39mg/L，而HS-130301和HS-130308等MIC由3.13mg/L下降到了1.56mg/L。即经过在没有烟酸诺氟沙星的培养基中传代5次后，烟酸诺氟沙星对F.coloumnare的4个菌株的MIC值均下降到了1/2。
表4柱状黄杆菌对烟酸诺氟沙星耐药性消除速率
3讨论
目前已经有较多的抗菌素类药物被批准作为水产用兽药治疗养殖动物的疾病。但是，这些药物从兽药生产企业用于申请生产许可证的技术资料，到药物被水产养殖者使用的各个环节都还存在一些问题。如兽药生产企业在申请生产某种抗菌素药类渔药时，所提供的申请技术资料大多只有药物对某些水产动物致病菌的抑、杀菌效果的相关实验结果，而没有提供药物的在对水产养殖动物使用的过程中，致病菌对药物耐药性产生变化的相关实验结果。又如由于我国的水产执业兽医制度处于刚刚起步阶段，疾病的诊断与药物的使用几乎全部是由水产养殖业者自己完成的。他们在选择某种水产用兽药作为水产养殖动物疾病治疗药物时，因为没有针对致病菌的药物敏感性实验结果作为选择药物和使用剂量的依据，就只能根据兽药生产企业提供的使用说明书选择和决定各种水产用兽药的使用剂量。
然而，致病菌对抗菌素类药物的敏感性是可以随着接触该药物次数而不断地变化的，接触某种抗菌素的次数越多，致病菌对这种抗菌素产生耐药性就越强。楠田等（1988）在五条鰤（Seriolaquinqueradiata）养殖现场分离大量的杀鱼巴斯德菌（Pasteurellapiscicida）菌株进行药物敏感性测定结果表明，该菌对多种抗生素产生的耐药性程度是不相同的。楠田等（1976）利用离体培养的方法观察P.piscicida对安比西林（ampicillin）和氯霉素（chloramphenicol）耐药性获得与消失速率的结果表明，P.piscicida在含有药物的培养基中经过10次传代培养，供试菌对安比西林的耐药性上升了4~8倍，而对氯霉素的耐药性上升了4倍。在本研究中观察了F.coloumnare的4个均质对烟酸诺氟沙星耐药性在离体培养过程中的变化，结果证明F.coloumnare在含有烟酸诺氟沙星培养基中经过9次传代后，供试菌株对烟酸诺氟沙星的耐药性就上升了4倍。与楠田利用P.piscicida对安比西林（ampicillin）和氯霉素（chloramphenicol）测定的耐药性获得速率结果相似。
为了避免水产动物致病菌产生耐药性，水产养殖业者在选择抗菌素类药物作为治疗水产动物传染性疾病治疗药物时，应该从患病动物体内分离致病菌并测定致病菌对拟选药物的敏感性，只有在获得各种抗菌素类药物对致病菌的MIC的基础上，水产用兽药的使用者才有可能作到正确选择药物和决定药物的准确用量，否则，就有可能因为不知道致病菌对不同种类抗菌素耐药性的变化背景，而造成实际上的盲目用药。
水产养殖动物的传染性疾病一旦发生，病程发展速度就比较快，而从患病鱼体中分离病原菌并完成药物敏感测定的试验是需要一定的时间的，养殖业者往往担心做这样的试验会贻误对疾病治疗的时机。为了防止这种情况的发生，养殖业者可以通过做好养殖日记的方法，避免将同类抗菌素类药物在同一个养殖环境中多次使用，当饲养的水产动物发生疾病时可以选择与以前选用的药物不同而且致病菌不会产生交叉耐药性的药物；也可以在养殖过程中定期检测养殖水产动物体内携带的致病菌对各种抗菌素类药物敏感性的变化，只有掌握了养殖水体和水产养殖动物体内致病菌对各种药物耐药性的变化状况，才有可能作到对症用药和科学用药，否则，用药种类的选择、剂量的控制以及用药程序的决定等就必然会带有盲目性。（参考文献略）【由江苏省水产三新工程项目（编号：D2013-5-1）资助。】
1、来源：腾氏水产商务网-当代水产杂志社
2、作者：华中农业大学陈昌福胡明江苏省渔业技术推广中心方苹陈辉全国水产技术推广总站冯东岳
3、腾氏水产商务网微信号：tsfish
