摘要：用环磷酰胺对黄鳝进行注射以造成实验性免疫抑制，再使用黄芪多糖注射液对其进行治疗实验。结果显示，阳性对照组与阴性对照组相比，黄鳝脾脏指数降低极明显（P<0.01），血清溶菌酶含量降低显著（P<0.05），血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性差异不显著（P>0.05）。治疗组与阳性对照组相比，黄鳝脾脏指数、血清溶菌酶含量与血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性极显著升高（p<0.01）,表明黄芪多糖对实验性免疫抑制黄鳝的免疫功能具有明显的增强作用。
关键词：黄芪多糖，免疫抑制，黄鳝
随着现代集约化和规模化水产养殖业的发展，各种鱼病的发生已经成为一个非常突出的问题，而长期使用抗生素和其它化学药物防治水产动物病害容易引起水体污染和抗药性。人们在寻求其它解决途径时已经认识到中草药是一种天然的、无污染的物质，中草药中含有生物碱、多糖、皂甙、蒽类、挥发油和有机酸等，它们与动物免疫功能密切相关。中草药的许多种类都是很好的免疫增强剂，可以提高机体的免疫水平。对于水产动物而言，更多的则是通过增加非特异性免疫即增加吞噬细胞的数量和吞噬能力，以及增加皮肤、粘液和血清中溶菌酶的活性等来实现。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。具有补气升阳、固表止汗、托毒生肌和利水消肿等功效。临床上应用相当广泛。黄芪具有增强动物免疫力，促进动物生长等功能，越来越多的被利用到畜禽生产中来。黄芪多糖（APS）是黄芪药理作用中起决定性因素的一类大分子化合物。
本试验对免疫抑制的黄鳝进行黄芪多糖的注射，分析某些非特异性免疫指标，希望能为黄芪多糖作为免疫增强剂的开发和利用提供一些参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验鱼：黄鳝（Monopterusalbus）体重为（57.48±9.81）g。选择体色、体况、体长基本一致的健康黄鳝300尾，随机分为5组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组），每组15尾鱼。各设一平行组。
1.1.2试验药品：环磷酰胺(cyclophosvnamide，Cy)、0.86%无菌生理盐水、黄芪多糖注射液（由北京生泰尔生物科技有限公司提供）。
1.2分组及采样
将黄鳝暂养2天后，随机分为5组，每组15尾置于水族箱中。各设一平行组。于第3d、第9d各腹腔注射药物一次。各组的给药剂量如下：
第Ⅰ组阴性空白对照组注射4.6ul/g体重的生理盐水；
第Ⅱ组阳性空白对照组注射1ul/g体重的环磷酰胺+3.6ul/g体重的生理盐水；
第Ⅲ组阳性用药低剂量组注射1ul/g体重的环磷酰胺+0.4ul/g体重的黄芪多糖注射液+3.2ul/g体重的生理盐水；
第Ⅳ组阳性用药中剂量组注射1ul/g体重的环磷酰胺+1.2ul/g体重的黄芪多糖注射液+2.4ul/g体重的生理盐水；
第Ⅴ组阳性用药高剂量组注射1ul/g体重的环磷酰胺+3.6ul/g体重的黄芪多糖注射液。
各组均在第15d采样。采样时，先称体重，之后用一次性医用注射器于尾静脉抽血，将血液置室温下静置2h析出血清后，于4000r/min离心10min，取血清4℃冰箱保存备用。
最后解剖黄鳝并称取脾脏重量。
1.3脾脏指数的测定方法
称量各组黄鳝体质量，处死后，迅速取出脾脏，去除其表面的包膜等组织，并立即用电子天平称脾脏质量，并计算相关指数。指数计算采用如下公式：
小鼠脾脏指数=脾脏质量(mg)／体质量(g)
1.4血清溶菌酶活性的测定方法
按南京建成生物工程研究所所提供的自身对照法进行检测。
1.4.1将配制好的应用菌液，标准应用液及所需检测的样本均放入37℃水浴箱中浴温5分钟以上。使菌液，标准液及检测样本的温度达到37℃。
1.4.2取试管38只，放到37℃水浴箱中，在试管中各加应用菌液2ml继续水浴。
1.4.3取4只25px光劲的比色皿，在可见光分光光度计上530nm处，用蒸馏水调透光度100%，然后倒掉蒸馏水。
1.4.4 将标准液应用液及待测样本0.2ml分别加入洗干净的比色皿底部，然后快速讲37℃水浴箱中浴温试管里的2ml应用菌液迅速倒入装有0.2ml样本的比色皿中。使0.2ml血清和2ml应用菌液充分混合，在530nm波长下测定反应5秒和2分零5秒时的透光光度值UT0和UT2，以及标准品和应用菌液的透光光度值ST0和ST2。
溶菌酶含量＝[（UT2－UT0）÷（ST2－ST0）]×10ug/ml。
1.5血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的测定
按南京建成生物工程研究所所提供的试验方法。
具体步骤如下：
1.6 数据统计方法
数据用平均数±标准误（Mean±SD）表示。各组数据用参比差值及SPSS11.0软件包进行统计分析，比较各处理组与对照组的差异显著，P<0.05表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。
2.结果
2.1黄鳝脾脏指数的变化
从上表可知，组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅱ（阳性对照组）之间差异极显著（P<0.01），组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ（治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均不显著（P>0.05），组Ⅱ（阳性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ（治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均为极显著（P<0.01），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅳ（治疗中剂量）之间差异不显著（P>0.05），组Ⅳ（治疗中剂量）与组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异显著（P<0.05），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异极显著（P<0.01）。结果表明，对健康黄鳝注射环磷酰胺药物后，可使其脾指数明显降低。而黄芪多糖可以显著提高黄鳝的脾指数，并且该黄芪多糖的疗效以低剂量为最理想，脾指数升高最显著，治疗高剂量的组别则相对差一些。
2.2血清溶菌酶活性与血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的变化
如上表所示，溶菌酶含量，组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅱ（阳性对照组）之间差异显著（P<0.05），组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ （治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均为极显著（P<0.01），组Ⅱ（阳性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ（治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均为极显著（P<0.01），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅳ（治疗中剂量）之间差异极显著（P<0.01），组Ⅳ（治疗中剂量）与组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异极显著（P<0.01），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异显著（P<0.05），结果表明，对健康黄鳝注射环磷酰胺药物后，可使黄鳝体内的溶菌酶含量明显降低。在一定范围内，该黄芪多糖可以显著提高黄鳝体内的溶菌酶含量。
SOD酶活性，组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅱ（阳性对照组）之间差异不显著（P>0.05），组Ⅰ（阴性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ（治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均为极显著（P<0.01），组Ⅱ（阳性对照组）与组Ⅲ（治疗低剂量）、组Ⅳ（治疗中剂量）、组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异均为极显著（P<0.01），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅳ（治疗中剂量）之间差异不显著（P>0.05），组Ⅳ（治疗中剂量）与组Ⅴ （治疗高剂量）之间差异极显著（P<0.01），组Ⅲ（治疗低剂量）与组Ⅴ（治疗高剂量）之间差异极显著（P<0.01）。结果显示，对健康黄鳝注射环磷酰胺药物后，可使黄鳝体内的SOD酶的活性明显降低。在一定范围内，黄芪多糖可以显著提高黄鳝体内的SOD酶的活性。并且，黄芪多糖的治疗剂量以低剂量为宜，随着剂量的增加，酶活性有降低的趋势。
3.讨论
3.1 黄芪多糖对免疫抑制的黄鳝的免疫器官指数的影响
鱼类的免疫器官主要有胸腺、肾脏和脾，其中肾和脾与体液免疫关系密切。有研究表明，饲料中添加某些中草药对鱼类的免疫器官重量会产生一定的影响，结果因中草药种类不同而不同。也有试验研究表明，饲料中添加中草药对鱼类的免疫器官指数并未产生显著影响。本试验采用环磷酰胺对黄鳝进行注射以造成实验性免疫抑制。结果显示通过使用黄芪多糖对其进行治疗，治疗组的黄鳝脾脏指数对于阳性空白组有显著升高。说明饲料中添加黄芪多糖对鱼类的免疫器官能起到一定作用。
3.2黄芪多糖对免疫抑制的黄鳝体内溶酶菌活性的影响
近年来，关于在鱼的饲料中添加中草药的研究有许多，而中草药确实被证实有提高鱼类非特异性免疫的功效，还有调整机体新陈代谢，提高抗应激能力，具有营养作用、诱食作用等多种功能。鱼类在中草药的作用下可以提高抵御环境不良刺激的能力，同时也可以达到防病治病的目的。
王远吉报道枸杞多糖可以增强鲫血清溶菌酶的活性；李桂峰等报道酵母多糖可以提高赤眼鳟非特异性免疫功能；曹振杰等首次在草鱼饲料中添加不同剂量的免疫多糖测定血清溶菌酶活性，结果显示免疫多糖对草鱼免疫系统有明显的激活作用。本试验分别对免疫抑制的黄鳝进行植物血凝素，黄芪多糖的注射，观察各组黄鳝的免疫增强作用的效果，在注射15d后对黄鳝血清中溶菌酶活性较对照组有所提高或显著提高，综合比较黄芪多糖增强剂作用效果比较显著。表明黄芪多糖可有效激活鱼体的非特异性免疫系统，从而达到防治疾病的目的。
3.3黄芪多糖对免疫抑制的黄鳝体内超氧化物歧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶(s~tperoxidedlsmutase，SOD)普遍存在于水产动物体内。它是含有铜、锌、锰和铁的金属酶，是唯一能够特异性清除自由基O2-(超氧阴离子自由基)的抗氧化酶。研究表明O2-具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症肿瘤和自身免疫性疾病，并能促使机体衰老，所以SOD清除O2-的作用对机体的抗病防衰显得尤为重要。SOD是通过歧化O2-而达到清除O2-的作用，可以说，它是机体内清除活性氧／自由基的第一道，也是十分重要的一道防线。在超氧化物歧化酶活性测试结果中，可得出在注射黄芪多糖增强剂的试验组中的超氧化物歧化酶活性明显比注射蒸馏水的对照组强，说明同样对受到免疫抑制的黄鳝，其体内自由基加多后，有注射增强剂的黄鳝体内超氧化物歧化酶可以增加许多，间接得出该免疫增强剂是有作用的。
从表3可以初步看出黄芪多糖对黄鳝体内SOD酶的活性有增强作用。
4.结论
从以上试验结果可知，添加黄芪多糖能显著提高黄鳝的脾指数，对鳝鱼溶菌酶的含量有增加的作用，对超氧化物歧化酶的活性也有增强作用。并且在一定范围内，随着黄芪多糖的增加，溶菌酶的含量也随之升高，超氧化物歧化酶的活性也增强。与黄芪多糖添加的治疗组相比，黄芪多糖的添加能更好的增加或提高黄鳝体脾指数，溶菌酶的含量及超氧化物歧化酶的活性。
