抗菌药物作用主要通过干扰病原菌的生化代谢过程，影响其结构与功能而产生抗菌作用。包括四点，抑制细菌细胞壁合成、参加或干扰细胞物质代谢过程、抑制细胞膜功能、抑制细菌蛋白质合成。
1、抑制细菌细胞壁合成
细菌细胞膜外是一层坚韧的细胞壁，能抗御菌体内强大的渗透压，具有保护和维持细菌正常形态的功能。细菌细胞壁主要结构成分是胞壁粘肽，由N-乙酰葡萄糖胺和与五肽相连的N-乙酰胞壁酸重复交替联结而成。胞壁粘肽的生物合成可分为胞浆内、胞浆膜与胞浆外三个环节。胞浆内粘肽前体的形成可被磷霉素与环丝氨酸所阻碍。研究发现磷霉素抑制有关酶系阻碍N-乙酰胞壁酸的形成；环丝氨酸通过抑制D-丙氨酸的消旋酶和合成酶阻碍了N-乙酰胞壁酸五肽的形成。胞浆膜阶段的粘肽合成可被万古霉素和杆菌肽所破坏，它们能分别抑制MNAc-五肽与脂载体结合并形成直链十肽二糖聚合物和聚合物转运至膜外受体的过程及脱磷酸反应。青霉素与头孢菌素类抗生素则能阻碍直链十肽二糖聚合物在胞浆外的交叉联接过程。青霉素等的作用靶位是胞浆膜上的青霉素结合蛋白表现为抑制转肽酶的转肽作用，从而阻碍了交叉联接。能阻碍细胞壁合成的抗生素可导致细菌细胞壁缺损。由于菌体内的高渗透压，在等渗环境中水分不断渗入。致使细菌膨胀、变形，在自溶酶影响下，细菌破裂溶解而死亡。
2、参加或干扰细胞物质代谢过
抗菌药物作用的机制是：①影响核酸合成，如喹诺酮类药物能抑制DNA的合成，利福平能抑制以DNA为模板的RNA多聚酶。②影响叶酸代谢，如磺胺类与甲氧苄啶，可分别抑制二氢叶酸合成酶与二氢叶酸还原酶，妨碍叶酸代谢，最终影响核酸合成，从而抑制细菌的生长和繁殖。
3、抑制细胞膜功能
细菌胞浆膜主要是由类脂质和蛋白质分子构成的一种半透膜，具有渗透屏障和运输物质的功能。A、多粘菌素类抗生素具有表面活性物质，能选择性地与细菌胞浆膜中的磷酯结合；B、制霉菌素和二性霉素等多烯类抗生素则仅能与真菌胞浆膜中固醇类物质结合。C、氨基糖苷类通过离子吸附作用等。它们均能使胞浆膜通透性增加，导致菌体内的蛋白质、核苷酸、氨基酸、糖和盐类等外漏，从而使细菌死亡。
4、抑制细菌蛋白质合成
细菌为原核细胞，其核蛋白体为70S，由30S和50S亚基组成，多种抗生素能抑制细菌的蛋白质合成，但它们的作用点有所不同。四环素类和氨基糖苷类的作用靶点在30S亚单位，林可霉素和大环内酯类作用于50S亚单位。抑制蛋白质合成的药物分别作用于细菌蛋白质合成的三个阶段：①起始阶段，氨基糖苷类药物抑制始动复合物的形成；②肽链延伸阶段，四环素类阻止活化氨基酸和tRNA的复合物与30S上A位点结合，林可霉素抑制肽酰基转移酶；③终止阶段，氨基糖苷类阻止终止因子与A位点的结合，诗的已经合成的肽链不能从核糖体上释放出来，核糖体循环受阻。
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